熒光定量PCR檢測
實(shí)驗介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)就是通過(guò)對PCR擴增反應中每一個(gè)循環(huán)時(shí)產(chǎn)物的熒光信號的實(shí)時(shí)監測從而實(shí)現對起始模板定量(即絕對定量PCR)及定性(即相對定量PCR)的分析,每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強度信號,這樣就可以通過(guò)熒光強度變化檢測產(chǎn)物量的變化,并據此推斷目的基因的初始量。絕對定量PCR不僅能測定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中含量的相對比值,還能測定目的基因在每個(gè)樣本中的具體拷貝數;相對定量PCR則只能測定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對比例,不能知道它們在每個(gè)樣本中的拷貝數。依據目的基因檢測難易度可進(jìn)行TaqMan檢測與SYBR檢測,前者能準確區分單個(gè)堿基的差別獲得最為準確的定量結果,但是其探針合成成分較高,而對于序列差別較大的基因,SYBR檢測不僅準確更為廉價(jià)。
先進(jìn)儀器: ABI系列儀器(ABI-Step One Plus qPCR儀、ABI-2720 PCR儀),高精度Eppendorf 8道電動(dòng)移液槍
Stepone plus qPCR儀:具有時(shí)間省、靈敏度高、準確性好和線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。
嚴格質(zhì)控: 預實(shí)驗檢測引物與模板結合特異性,優(yōu)化實(shí)驗條件,并通過(guò)嚴格的對照實(shí)驗保證結果準確性,樣本全程干冰或液氮運輸;保證三次重復的CT值≤0.5
頂級試劑: 頂級品牌Invitrogen等試劑、ABI原裝PCR反應板和膜
服務(wù)流程: 核酸提取及質(zhì)量分析、預實(shí)驗條件優(yōu)化、正式實(shí)驗樣品四次重復檢測、實(shí)驗報告包含數據分析、擴增曲線(xiàn)、融解曲線(xiàn)(注:公司提供儀器原始數據及軟件,保證絕無(wú)修改)
樣品要求:盡可能新鮮和足量的組織(>50-100mg)、細胞樣品106以上等,對于樣本量很少或極少(25-105細胞或者約10mg組織),其他請事先咨詢(xún)。
交付結果:實(shí)驗報告,樣本返還
質(zhì)量保證:客觀(guān)、公正、可信數據結果
交付時(shí)間:大約5-10個(gè)工作日(根據預實(shí)驗、樣本數量情況決定)
服務(wù)項目: 相對定量qPCR檢測(SYBR Green/TaqMan探針?lè )ǎ┘皹藴势分苽?/span>
絕對定量PCR檢測及標準品制備
qPCR引物設計合成、TaqMan探針?lè )ㄔO計合成
服務(wù)流程1、 依據客戶(hù)提供的基因ID或基因名稱(chēng)設計合成引物(含驗證)
2、 標準品制備:只針對于絕對定量,相對定量多種內參可供選擇(mRNA qPCR檢測:β-actin,GAPDH或客戶(hù)提供特異性?xún)葏?;microRNA qPCR檢測:以U6為內參)
3、 RNA提取及RNA質(zhì)量分析:采用Invitrogen的TRIzol 進(jìn)行裂解提取,RNA提取質(zhì)量有瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計雙重質(zhì)控
4、 逆轉錄:嚴格按照f(shuō)ermentas的反轉錄試劑盒要求抽取質(zhì)控合格的RNA,并且可提供oligo(dT)、隨機引物、基因特異性引物以及混合引物幾種模式進(jìn)行反轉錄,以最大程度的確保反轉錄酶的反轉效率
5、 預實(shí)驗驗證樣品和引物:依據客戶(hù)選定內參及基因,對客戶(hù)全部樣本內參及個(gè)別樣本基因進(jìn)行驗證,以確保樣本的反轉錄情況及基因的設計
6、 正式實(shí)驗:在以上所有質(zhì)控合格的情況下,每個(gè)樣本每個(gè)基因進(jìn)行四個(gè)復孔的重復檢測,確保至少提供三個(gè)復孔Ct≤0.5的數據
7、 實(shí)驗報告:提供詳細的實(shí)驗報告,包括RNA提取電泳圖、擴增曲線(xiàn)、溶解曲線(xiàn)及數據結果分析
樣本要求細胞(≥106個(gè)):必須是活細胞,貼壁或懸浮均可
組織(≥50mg):盡量新鮮并且切取之后立即置于液氮或-80℃保存
石蠟切片(≥10張):厚度10-20μm,石蠟組織塊或固定組織均可
全血(2ml以上):抗凝管4℃運輸,短期保存,分離后血清亦可
以上樣本依據提取情況可進(jìn)行1-10個(gè)基因的檢測
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