熒光定量PCR檢測
實(shí)驗介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）就是通過(guò)對PCR擴增反應中每一個(gè)循環(huán)時(shí)產(chǎn)物的熒光信號的實(shí)時(shí)監測從而實(shí)現對起始模板定量（即絕對定量PCR）及定性（即相對定量PCR）的分析，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強度信號，這樣就可以通過(guò)熒光強度變化檢測產(chǎn)物量的變化，并據此推斷目的基因的初始量。絕對定量PCR不僅能測定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中含量的相對比值，還能測定目的基因在每個(gè)樣本中的具體拷貝數；相對定量PCR則只能測定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對比例，不能知道它們在每個(gè)樣本中的拷貝數。依據目的基因檢測難易度可進(jìn)行TaqMan檢測與SYBR檢測，前者能準確區分單個(gè)堿基的差別獲得最為準確的定量結果，但是其探針合成成分較高，而對于序列差別較大的基因，SYBR檢測不僅準確更為廉價(jià)。
先進(jìn)儀器： ABI系列儀器（ABI-Step One Plus qPCR儀、ABI-2720 PCR儀），高精度Eppendorf 8道電動(dòng)移液槍
Stepone plus qPCR儀：具有時(shí)間省、靈敏度高、準確性好和線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。
嚴格質(zhì)控： 預實(shí)驗檢測引物與模板結合特異性，優(yōu)化實(shí)驗條件，并通過(guò)嚴格的對照實(shí)驗保證結果準確性，樣本全程干冰或液氮運輸；保證三次重復的CT值≤0.5
頂級試劑： 頂級品牌Invitrogen等試劑、ABI原裝PCR反應板和膜
服務(wù)流程： 核酸提取及質(zhì)量分析、預實(shí)驗條件優(yōu)化、正式實(shí)驗樣品四次重復檢測、實(shí)驗報告包含數據分析、擴增曲線(xiàn)、融解曲線(xiàn)（注：公司提供儀器原始數據及軟件，保證絕無(wú)修改）
樣品要求：盡可能新鮮和足量的組織（＞50-100mg）、細胞樣品106以上等，對于樣本量很少或極少（25-105細胞或者約10mg組織），其他請事先咨詢(xún)。
交付結果：實(shí)驗報告，樣本返還
質(zhì)量保證：客觀(guān)、公正、可信數據結果
交付時(shí)間：大約5-10個(gè)工作日（根據預實(shí)驗、樣本數量情況決定）
服務(wù)項目： 相對定量qPCR檢測（SYBR Green/TaqMan探針?lè )ǎ┘皹藴势分苽?/span>
絕對定量PCR檢測及標準品制備
qPCR引物設計合成、TaqMan探針?lè )ㄔO計合成
服務(wù)流程1、 依據客戶(hù)提供的基因ID或基因名稱(chēng)設計合成引物（含驗證）
2、 標準品制備:只針對于絕對定量，相對定量多種內參可供選擇（mRNA qPCR檢測：β-actin，GAPDH或客戶(hù)提供特異性?xún)葏?；microRNA qPCR檢測：以U6為內參）
3、 RNA提取及RNA質(zhì)量分析：采用Invitrogen的TRIzol 進(jìn)行裂解提取，RNA提取質(zhì)量有瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計雙重質(zhì)控
4、 逆轉錄：嚴格按照f(shuō)ermentas的反轉錄試劑盒要求抽取質(zhì)控合格的RNA，并且可提供oligo(dT)、隨機引物、基因特異性引物以及混合引物幾種模式進(jìn)行反轉錄，以最大程度的確保反轉錄酶的反轉效率
5、 預實(shí)驗驗證樣品和引物：依據客戶(hù)選定內參及基因，對客戶(hù)全部樣本內參及個(gè)別樣本基因進(jìn)行驗證，以確保樣本的反轉錄情況及基因的設計
6、 正式實(shí)驗：在以上所有質(zhì)控合格的情況下，每個(gè)樣本每個(gè)基因進(jìn)行四個(gè)復孔的重復檢測，確保至少提供三個(gè)復孔Ct≤0.5的數據
7、 實(shí)驗報告：提供詳細的實(shí)驗報告，包括RNA提取電泳圖、擴增曲線(xiàn)、溶解曲線(xiàn)及數據結果分析
樣本要求細胞（≥106個(gè)）：必須是活細胞，貼壁或懸浮均可
組織（≥50mg）:盡量新鮮并且切取之后立即置于液氮或-80℃保存
石蠟切片（≥10張）：厚度10-20μm，石蠟組織塊或固定組織均可
全血（2ml以上）：抗凝管4℃運輸，短期保存，分離后血清亦可
以上樣本依據提取情況可進(jìn)行1-10個(gè)基因的檢測
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